Doku Mühendisliği Çalışmalarında in vitro Hücre Kültürü | 2D ve 3D

13. Hafta


Yakın bir geçmişe kadar hücre kültürü denildiği zaman akla ilk gelen görsel çoğunlukla (hatta belki de yalnızca) plastik kaplar içerisinde pembe/kırmızı sıvılar yardımıyla yapılan deneyler oluyordu. Ancak şu an bu algı değişti; artık akıllara plastik kaplar içerisinde pembe/kırmızı sıvılar yardımıyla yapılan deneyler geliyor!

Değişmedi mi yoksa bu algı?

Çeşitli hücre kültürü kapları – Kaynak

Önce temel tanımlar ile başlayalım;

in vitro hücre kültürü dediğimiz çalışma, bir kaynaktan elde edilen hücrelerin uygun ve kontrollü koşullar altında çoğaltılması ve/veya farklılaşmanın sağlanması çalışmalarını kapsamaktadır. İlk olarak Ross Harrison’ın 1907 yılında yaptığı çalışma (1) ile kullanılmaya başlanmış teknik, günümüzde o kadar yaygın bir şekilde kullanılıyor ki neredeyse her gün yeni bir hücre kültürü deneyi yapılıyor (…diyerek bir istatistik uydursam bence yanlış olmaz).

Bu çalışmalar, elimizdeki çoğalma yetisine sahip hücrelerin fizyolojik ortamı taklit eden bir ortam içerisinde bekletilerek üremelerine zaman tanınması temelinde yürütülür.

Fizyolojik ortamı takli eden ortam; 37°C sıcaklık ile nemli bir ortam, %5 karbondioksit (CO2) içeren hava ve gerekli bazı biyolojik bileşenlerden oluşuyor. Bu bileşenler arasında bazı gerekli proteinler, karbohidratlar gibi unsurlar bulunuyor.

Eğer çalıştığımız hücreleri düzlemsel bir yüzey üzerinde (yukarıdaki görselde görebileceğiniz plastik kaplar gibi; zaten in vitro terimi de buradan geliyor: lat. cam üzerinde) çoğaltırsak bu bir 2 boyutlu (2D) hücre kültürü çalışması olur. Hücreler genellikle bu kapların üretildiği malzemeye yapışarak çoğalır ve böylelikle 2D bir tabaka şeklinde hücre topluluğu elde edilir.

Doku mühendisliği işleyiş mekanizması temelinde hücre kültürü çalışması şematiği

Şimdi, hücre kültürü çalışmasını yukarıdaki görsel üzerinden tekrar inceleyelim. Elimizde kaynaktan (yaprak) kırmızı oklar yönünde ilerleyerek elde ettiğimiz hücreler, uygun koşullarda çoğaltılabiliyor. Önceki yazılardan da hatırlayacağımız üzere doku mühendisliği çalışmaları da bu mekanizma üzerinden ilerliyordu. Bu bağlamda, elimizdeki hücreleri mavi oklar yönündeki gibi çoğaltarak bir doku (yaprak) elde edebiliyoruz.

Bu hücreleri 2D bir düzlem üzerine yapıştırarak çoğaltmak yerine farklı bir seçenek düşünecek olursak, işin içine 3 boyutlu (3D) hücre kültürü kavramı girmiş oluyor. 3D hücre kültürü çalışmaları tek bir teknik üzerinden ilerlemiyor. Farklı farklı yöntemler var ve genellikle kullandığınız yöntem, elde edeceğiniz hücre topluluğu üzerinde çeşitli etkilere sahip oluyor.

Bu yöntemlerin bir kısmına biraz yüzeysel bir giriş yapabiliriz bu yazı dizisi kapmasında.

2D hücre kültürü ve çeşitli 3D hücre kültürü yöntemleri

A seçeneği

Bu yöntem zaten yukarıda anlattığımız şekilde tipik bir 2D hücre kültürü çalışmasını gösteriyor. Gördüğünüz gibi hücreler düzlemsel bir şekilde çoğalıyor. Çoğalan hücreleri kağıt şeklinde düşünebilirsiniz. Bu yöntem uygulanma basitliği ve hücrelerin homojen bir ortam içerisinde bulunarak kontrol edilebilir şekilde manipülasyona imkan sağladığı için yaygın bir şekilde kullanılıyor.

Ucuz ve kolay uygulanabilir olması 2D hücre kültürünün en büyük avantajları arasında olmasına rağmen ortamdaki hücrelerin bütün bir dokunun özelliklerini tamamen karşılamıyor oluşu, yöntemin en önemli dezavantajı. Ayrıca yüksek sayıda tekrar ile pasajlanan (bir kültür ortamında çoğalmış hücrelerin bir kısmının kaynak/ana olarak kullanılarak tekrar çoğaltılmaları) hücrelerin gen ekspresyon mekanizmalarının bozulduğu ve biyokimyasal özelliklerinin değiştiği gözlemlenmiştir.

B seçeneği

Bu yöntemde ise şekilden de görebileceğiniz üzere ortamda bir biyomateryal ihtiyacı var. Fakat ondan önce tanımlamamız gereken farklı bir terim ile karşı karşıyayız burada; spheroid. İngilizce sphere / küre kelimesinden türemiş bir terim

Motamot “küresel cisimcik” şeklinde çevirebileceğimiz spheroid, bir araya gelmiş az sayıda hücrenin oluşturduğu, topaklanmış küresel yapıları tanımlamak için kullanılıyor. Buradaki önemli noktalardan birisi, spheroidlerin doku özelliği göstermiyor olması. Yani elimizde yalnızca bir araya gelmiş, doku işlevi kazanmasına yardımcı olacak hücreler arası ortam (extracellular matrix / ECM) üretimi gerçekleşmemiş bir yapı var.

Spheorid örnek gösterimi; kırmızı yapıların her birisi hücre – Kaynak

Elimizdeki spheroidleri veya tekil hücreleri destek görevi görecek (ECM benzeri bir işleve sahip) bir biyomateryal üzerine yerleştirirsek / ekersek, hücreler bu biyomateryalden destek alarak üreyecekler. Bu biyomateryal, biyouyumlu herhangi bir polimerik karışım olabilir. Burada unutulmaması gereken nokta, fizyolojik ortamın sağlanması hala önemli. Yani üzerine hücre ekilmiş biyomateryali 2D hücre kültürü çalışmasında olduğu gibi fizyolojik şartlar altında tutmamız gerekiyor.

C seçeneği

Burada da B seçeneğinde uygulanan tekniğin neredeyse aynısı ile karşı karşıyayız. Tek bir fark var, spheroidler veya tekil hücreler, biyomateryalin üzerine değil direkt olarak içine gömülü halde bulunuyor. Bu tekniğin diğerine göre bir avantajı bulunuyor. Bu avantaj, hücrelerin biyomateryal ile daha homojen bir şekilde etkileşim halinde bulunuyor olması. Bu durum, hücrelerin doğal ortamları içerisindeymiş gibi hareket etmelerine olanak sağlıyor.

Bu seçenekte hücrelerin etrafı biyomateryal ile tamamen sarılı olduğu için (biyomateryalin ECM taklit ettiğini unutmayın), hücreler daha homojen bir şekilde çoğalacak ve in vivo şartlarda sahip oldukları kimliklerine oldukça yakın bir davranış sergileyecekler.

D seçeneği

Bu seçenek ise en yaygın biçimde kullanılan 3D hücre kültürü yöntemlerinden birisi. Bu sefer bir biyomateryal ihtiyacımız yok ve çeşitli teknikler ile elde ettiğimiz spheroidler bir biyomateryal ile direkt etkileşim halinde değil. Onun yerine hücre kültürü ortamı (fizyolojik ortamı taklit eden biyolojik unsurlar) içerisinde süspansiyon / ortamda asılı halde bulunarak çoğalıyorlar.


Not: Bu konuda literatürde karşılaşabileceğiniz organoid ve embryoid terimleri var. Bunlarla ilgili farklı bir yazı altında konuşacağız.


Femur şeklinde bir scaffold (2)

Doku mühendisliği ile ilgili ilk yazılardan beri üzerinde durduğumuz scaffold / doku iskelesinin devreye girdiği nokta tam olarak burası işte. B ve C seçeneklerinde ortamda kullandığımız ECM taklit eden biyomateryal, aslında scaffold! Biz 3D hücre kültürü çalışmamızı bir scaffold kullanarak gerçekleştirdiğimiz zaman, ve bu scaffold hedeflediğimiz doku şeklindeyse (görseldeki femur mesela), hücreler bu scaffold içerisinde çoğalarak (ve ihtiyaç halinde farklılaşarak) hedeflediğimiz şekilde bir doku elde etmemizi sağlayacak. Femur örneğinde, biyomateryal içerisine kemik hücresi gömdüğümüzü düşünelim. Bu hücreler çoğaldıkça kendi ECM materyallerini ortama salacaklar (ki bu ECM sayesinde kemik dokusu özellikleri görülemeye başlanacak) ve belli bir süre sonra elimizde femur şeklinde bir kemik dokusu oluşacak.

İşte bu kadar basit … değil tabi ki. Bu aşamalarda henüz bahsetmediğimiz pek çok farklı etken var. Fakat temel olarak doku mühendisliği çalışmalarının işleyişi bu şekilde.


Konu özeti karşılaştırma tablosu

2D vs 3D in vitro hücre kültürü özellikleri

Kaynakça

  • [1] R.G. Harrison, M.J. Greenman, F.P. Mall, C.M. Jackson, Observations of the living developing nerve fiber, Anat. Rec. 1 (1907) 116–128. doi:10.1002/ar.1090010503.
  • [2] B. Duan, M. Wang, Customized Ca-P/PHBV nanocomposite scaffolds for bone tissue engineering: design, fabrication, surface modification and sustained release of growth factor, J. R. Soc. Interface. 7 (2010) S615–S629. doi:10.1098/rsif.2010.0127.focus.

İleri okuma

  • Y. Luo, G. Engelmayr, D.T. Auguste, L. da Silva Ferreira, J.M. Karp, R. Saigal, R. Langer, 3D Scaffolds, in: Princ. Tissue Eng., Elsevier, 2014: pp. 475–494. doi:10.1016/B978–0–12–398358–9.00024–0
  • M. Kapałczyńska, T. Kolenda, W. Przybyła, M. Zajączkowska, A. Teresiak, V. Filas, M. Ibbs, R. Bliźniak, Ł. Łuczewski, K. Lamperska, 2D and 3D cell cultures — a comparison of different types of cancer cell cultures, Arch. Med. Sci. 14 (2018) 910–919. doi:10.5114/aoms.2016.63743
  • K. Duval, H. Grover, L. Han, Y. Mou, A.F. Pegoraro, J. Fredberg, Z. Chen, Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture, Physiology. 32 (2017) 266–277. doi:10.1152/physiol.00036.2016
  • Ravi, M. , Paramesh, V. , Kaviya, S. , Anuradha, E. and Solomon, F. P. (2015), 3D Cell Culture Systems: Advantages and Applications. J. Cell. Physiol., 230: 16–26. doi:10.1002/jcp.24683
  • https://www.thermofisher.com/blog/cellculture/a-brief-history-of-spheroids-and-3d-cell-culture/

Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logosu

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Twitter resmi

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Facebook fotoğrafı

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Connecting to %s

WordPress.com'da bir web sitesi veya blog oluşturun

Yukarı ↑

Web sitenizi WordPress.com ile oluşturun
Başla
%d blogcu bunu beğendi: